细胞色素P450过加氧酶能够直接利用过氧化氢驱动碳氢键羟化、脱甲基等反应，为药物中间体及精细化学品的绿色合成提供了重要工具。由于催化过程中未被底物有效利用的高活性氧化中间体会攻击活性中心的血红素和蛋白质本身致使酶失活，限制其持续催化能力，如何在保留氧化活性的同时减少酶自身受到的氧化损伤，是提升P450过加氧酶性能的重要问题。

针对这一问题，青岛能源所一碳生物技术研究中心丛志奇研究员团队，基于前期建立的“双功能小分子协同P450酶催化”体系（Acc. Chem. Res.2024, 57, 613-624），借鉴天然氧化还原蛋白通过酪氨酸和色氨酸传递氧化当量、减轻氧化损伤的保护机制，在P450酶表面引入氧化还原敏感残基（redox-active residue）突变，构建额外的辅助“空穴陷阱”，以提高P450过加氧酶对非生产性氧化损伤的抵抗能力。

研究团队以P450BM3 F87A为出发酶，围绕表面潜在的空穴捕获位点引入酪氨酸或色氨酸，获得了多种催化性能改善的变体。随后，通过不同底物反应验证改造效果，发现这些变体在茚满、对二甲苯和乙苯羟化反应中均表现出活性提升，验证了这一策略对不同底物过加氧酶催化性能的改善作用。此外，以同时参与过加氧酶和过氧化物酶反应路径的愈创木酚为底物，变体普遍增强过加氧酶介导的脱甲基反应，而对过氧化物酶介导的单电子氧化影响较小且因变体而异；多数变体中过加氧酶反应占比提高，最高近90%。动力学分析表明，活性提升主要体现为催化周转速率的提高，而底物的米氏常数变化相对较小。

为进一步考察活性提升是否与酶的氧化保护有关，研究团队选取组合变体M8开展血红素衰减和外加还原剂抗坏血酸的实验。结果表明，M8在多种条件下均表现出更慢的血红素衰减。在较高双功能小分子浓度下，加入还原剂抗坏血酸钠可使M8的乙苯羟化TON提高至1578，约为未添加抗坏血酸时的7.3倍。此外，1.70 Å分辨率的晶体结构显示，引入的色氨酸改变了局部氢键和芳香残基之间的相互作用，扩展了酶表面的π–π相互作用网络。综合考虑以上结果，这些发现支持表面氧化还原敏感残基工程，通过辅助或构建空穴陷阱来减轻非生产性氧化损伤，帮助酶提高催化能力，并参与酶的氧化保护过程。

研究团队还将这一策略拓展至另一类工程化P450过加氧酶CYP199A4。在D251Q/T252E变体中引入V206Y后，4-甲氧基苯甲酸脱甲基反应的TON由134提高至883，约为亲本的6.6倍；在F182A背景中，引入E317Y也提高了催化性能。不同酶背景中的有利位点有所差异，说明表面氧化还原残基的作用与酶自身的结构环境密切相关。综上，该研究开发出通过表面氧化还原敏感残基工程改善P450过加氧酶的催化性能的新策略，为改善蛋白质抗氧化损伤能力提供了新的设计思路。

相关研究成果以“Engineering of Redox-Active Residues Enhances P450 Peroxygenase Performance”为题发表在国际学术期刊 Angewandte Chemie International Edition《德国应用化学》。青岛能源所博士生汪子涵、项目副研究员秦鸣铭博士为论文共同第一作者，丛志奇研究员为通讯作者。李福利研究员、汪辉研究员、姚富泉、张正一、秦相全博士、以及厦门大学王斌举教授和博士生汪永超等对本论文也做出重要贡献。研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省泰山学者计划等项目的支持。（文/汪子涵 图/汪子涵 秦鸣铭）

原文链接：http://doi.org/10.1002/anie.3845288