萜烯化合物，既包括大宗化学品异戊二烯又包括高能量密度燃料蒎烯等，在材料、能源和医药等领域具有极高的应用价值。以可再生糖为原料，利用绿色可持续的微生物代谢工程合成萜类物质是当前生物化工领域的研究重点，其中微生物可利用的外源甲羟戊酸（MVA）途径因其高效性和较好的可调控性是当前研究的热点。MVA途径从前体乙酰辅酶A到二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的合成路线涉及到7步反应和7个酶，如何突破限制该途径效率的点并平衡协调这7个酶的合成路线，从而提升代谢效率、平衡代谢流，同时防止中间产物对宿主细胞的毒性，是该途径的突破点和难题。

　　图1. 代谢限制性位点MK的定向进化策略和效果图

　　青岛能源所生物基材料组群张海波研究员带领的精细化学品研究组长期致力于萜烯化合物的生物合成，重点针对MVA途径的酶甲羟戊酸激酶（MK）、异戊烯焦磷酸异构酶（IDI）和萜烯合成酶等几个限制性点，同时统筹代谢流和中间产物毒性，平衡整条合成路线，在点线结合提升萜类化合物合成的MVA途径的效率上取得了新的突破。首先，针对MVA途径中的MK和IDI，通过不同物种来源筛选、随机突变和半理性设计进行定向进化和优化，获得了酶活性提高的MK（RSC Advances, 2018）和IDI (Microbial Cell Factories, 2018)，从而减弱代谢流在MK和IDI位点的阻滞，最终提高萜烯化合物的产量（图1 MK的定向进化策略和效果图）。其次，统筹MVA途径涉及到的多步反应，对酶表达量的调控涉及的多个水平。该研究选取翻译水平上的调控方法，避免了RNA的不稳定和翻译后水平调控的菌体代谢负担问题，通过调整不同酶的核糖体结合位点（RBS）序列的手段，调控不同酶的表达，平衡整条代谢路线。对非限制酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（MvaE）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（ERG19），调节其RBS序列，使其翻译起始效率（T.I.R.）降低，降低其蛋白表达量。对限制性酶MK和IDI，调节其RBS序列，使其T.I.R.提高，提高其蛋白表达量。通过对甲羟戊酸途径中的不同的酶的蛋白表达量的调控，实现了代谢流的平衡，最终提高了萜烯化合物的产量（图2 非限制酶和限制酶RBS序列优化策略）。

图2 非限制酶和限制酶RBS序列优化策略

　　上述研究获得了中国科学院青年创新促进会、国家自然科学基金等项目资助。（文/图 李美洁 陈海林 张海波）

　　相关成果发表：

　　[1] Chen H, Li M, Liu C, Zhang H, Xian M, Liu H: Enhancement of the catalytic activity of Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) from Saccharomyces cerevisiae through random and site-directed mutagenesis. Microbial Cell Factories 2018, 17(1). Doi: 10.1039/c8ra01783b

　　[2] Chen H, Liu C, Li M, Zhang H, Xian M, Liu H: Directed evolution of mevalonate kinase in Escherichia coli by random mutagenesis for improved lycopene. RSC Advances 2018, 8(27):15021-15028. Doi: 10.1186/s12934-018-0913-z

　　[3] Li M, Nian R, Xian M, Zhang H: Metabolic engineering for the production of isoprene and isopentenol by Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 2018, Doi:10.1007/s00253-018-9200-5.

　　[4] Li M, Liu C, Chen H, Deng L, Zhang H, Nian R, Xian M: Biochemical characterization of isoprene synthase from Ipomoea batatas. Journal of Bioscience and Bioengineering 2018, Accepted.