硝基化合物作为一种高附加值的化工中间体，在医药、农药、炸药等领域均有广泛应用。目前工业硝化具有产物选择性差，环境污染严重以及反应条件苛刻等多种缺陷。尽管条件温和的生物硝化方法是值得期待的可替代途径，然而自然界已知的硝化酶仅有N-加氧酶、过氧化物酶和细胞色素P450酶几种，且普遍存在催化效率底、底物谱窄和产物区域选择性差等不足，远远不能满足工业应用的需求。因此开发新型生物硝化酶具有重要意义。
近年来，青岛能源所丛志奇研究员带领的单碳酶催化研究组在国际上首次提出双功能小分子（DFSM）协同P450酶催化概念（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 7628， Very Important Paper，Highlight by ChemistryViews），成功构建了人工P450过加氧酶（peroxygenase）催化体系，实现了气态烷烃分子的选择羟化（ACS Catal. 2019, 7350-7355）、苯乙烯的高度R-对映选择性环氧化（Chem. Sci. 2021, 6307-6314. Back cover, highlighted in “hot off the press” in Nat. Prod. Rep. 2021, 1053）、碳-氢键区域和立体多样性选择羟化（Angew. Chem. Int. Ed. 2022, e202215088，Hot Paper）。最近，研究人员利用酶化学机制指导的蛋白质工程策略成功开发出双功能分子协同P450催化的过氧化物酶（peroxidase）新功能（ACS Catal. 2021, 11, 8449-8455. Featured in Faculty Opinions），拓展了P450酶的化学应用空间，为开发碳-氢键氧化官能化提供了新策略。
研究人员在上述工作基础上，运用酶工程技术，在过氧化反应中起关键作用的氨基酸位点引入空间位阻效应，阻止底物靠近活性中心发生过加氧反应，强化其过氧化物酶功能，首次开发出工程化P450酶成功实现了不饱和烃的直接硝化。通过叠加底物口袋关键位点突变，使底物谱范围覆盖19个芳香化合物和9个末端芳基烯烃化合物。获得了迄今为止催化效率最高、底物范围最广的人工P450硝化酶。其中4-氟苯酚的硝化活性最高，其半制备反应的分离产率达到49%。研究人员进而通过晶体学研究和自由基捕获与控制实验揭示了直接硝化反应机理。这一研究成果不但为生物催化硝化开辟了新的途径，而且为促进P450工程酶的过氧化物酶功能在合成化学和合成生物学领域的应用提供了新思路。
相关工作近日已在线发表于国际权威期刊Angew. Chem. Int. Ed.《德国应用化学》。青岛能源所王曦翎博士、林晓丹硕士、姜谊平博士、秦相全为论文共同第一作者，青岛能源所丛志奇研究员为通讯作者，青岛能源所东升博士、冯银刚研究员、咸漠研究员，延边大学金龙一教授等对本工作亦有贡献。本研究得到山东省自然科学基金、国家自然科学基金、国家重点研发计划等的大力支持（文/图 王曦翎 丛志奇）。
Wang, X.#, Lin, X.#, Jiang, Y.#, Qin, X.#, Ma, N., Yao, F., Dong, S., Liu, C., Feng, Y., Jin, L., Xian, M., and Cong, Z.* Engineering Cytochrome P450BM3 Enzymes for Direct Nitration of Unsaturated Hydrocarbons. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, e202217678.
