微生物单细胞全基因组测序是微生物学研究和生物技术产业的强大工具，但其核心技术瓶颈是如何实现精确到一个细菌细胞的高活性且高覆盖度的基因组DNA扩增。针对这一微生物业界共性技术瓶颈以及试剂行业的“卡脖子”问题，青岛能源所单细胞中心张佳副研究员等通过蛋白质理性设计和过程工程，发明了HotJa Phi29 DNA聚合酶，进而开发了名为iSGA（Improved Single-cell Genome Amplification）的单细胞全基因组扩增技术，实现了高活性且高覆盖度的单细菌菌体全基因组扩增，覆盖度最高可达99.75%。相关成果发表于《生物工程与生物技术前沿》(Frontiers in Bioengineering and Biotechnology)。

　　基于HotJa Phi29 DNA聚合酶的iSGA单细胞全基因组扩增技术，实现了高活性且高覆盖度的细菌单细胞全基因组扩增

　　单个细胞是地球上生命的功能单元和进化单位，因此单细胞精度的基因组测序能够在最“深”的水平理解生命的遗传多样性、功能异质性及其共进化机制。但是，与单个哺乳动物细胞相比，单个细菌的体积只是其千分之一，其中的DNA含量非常低，通常只有几个皮克，因此在进入测序环节之前进行单细胞DNA的提取和扩增至关重要。但是，目前的单细胞基因组扩增方法，例如MDA（多重置换扩增）、DOP-PCR（简并寡核苷酸引发的聚合酶链式反应）和MALBAC（基于多重退火和循环的扩增循环）等，对于微生物细胞存在一定的方法学局限或技术缺陷。首先，针对细菌单细胞，用于基因组扩增的DNA聚合酶活性较低，经常扩增不出有效产物，导致单细胞DNA扩增反应的成功率低。同时，由于DNA聚合酶工作过程中对不同碱基组成的区域扩增效率不同，这种扩增的“偏好性”，造成下游全基因组测序的覆盖度参差不齐，导致最终单细胞全基因组的覆盖度很低（通常低于30%），难以完成基因结构与功能预测、代谢途径重建等关键分析。

　　针对上述问题，研究团队首先基于酶理性设计原理，通过引入二硫键和点突变，提高了野生型Phi29 DNA聚合酶的扩增活性。其次，通过将GB1蛋白质与Phi29 DNA聚合酶融合，提高了目标酶的溶解度，这进一步提高了酶的扩增效率。最后，通过解决扩增过程中核酸污染问题，以及优化缓冲液配方，构建了以HotJa Phi29 DNA聚合酶为核心、高活性且高覆盖度的单细胞全基因组扩增系统（iSGA技术）。

　　利用iSGA技术，在更高温度（40°C）条件下，针对纯培养大肠杆菌单个细胞，全基因组覆盖度最高可达99.75%。针对实际益生菌产品中乳酸菌单细胞DNA扩增和测序，iSGA技术仍然能产出高扩增均衡性、高测序覆盖度的全基因组序列，覆盖度最高可达93.59%。与已公开报道中扩增酶活性最高的商品化单细胞基因组扩增酶（产自美国赛默飞ThermoFisher）相比，iSGA技术基于国产原创的HotJa Phi29 DNA聚合酶，综合性能高出2倍，而价格却便宜了11倍。这一单细胞测序质量和效率的大幅提升，使得“随心所欲”的微生物单细胞基因组分析成为可能。

　　此外，HotJa Phi29 DNA聚合酶与iSGA技术具有良好的可拓展性，除了细菌和真菌之外，还可应用于人体、动物、植物和藻类的单细胞DNA扩增。基于该成果的微生物单细胞全基因组测序试剂盒，目前正在与青岛星赛生物合作进行产业化推广。

　　该工作由单细胞中心徐健研究员、张佳副研究员和山东大学王纪超副研究员等合作主持，得到了国家自然科学基金、山东省自然科学基金和国家重点研发计划青年科学家项目等的支持。（文/张佳 图/刘阳）

　　原文链接：https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1233856

　　Jia Zhang#, Xiaolu Su#, Yefei Wang#, Xiaohang Wang, Shiqi Zhou, Hui Jia, Xiaoyan Jing, Yanhai Gong, Jichao Wang*, Jian Xu*. Improved single-cell genome amplification by a high-efficiency phi29 DNA polymerase. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2023, 11:1233856.