青岛能源所发表非天然P450过氧化酶创制新兴策略评述
近日，青岛能源所一碳生物技术中心单碳酶催化研究组丛志奇研究员、博士生范圣贤受邀撰写了将细胞色素P450单加氧酶改造成过氧化酶（包括过加氧酶和过氧化物酶）新兴策略的评述，系统总结了研究团队近年来发展的几个非天然P450过氧化酶元件分子设计和创制新策略、及其在催化碳-氢键选择氧化中的应用。
细胞色素P450单加氧酶是自然界中分布最为广泛的氧化酶之一，其广泛的覆盖底物范围和多样的催化功能使其拥有着“万能生物催化氧化剂”的美誉，在生物催化与转化、合成化学与合成生物学领域中都有着巨大应用潜力。P450催化功能对烟酰胺辅因子NAD(P)H和氧化还原伴侣蛋白的依赖极大限制了其在体外的实际催化应用，其次，P450酶的催化循环中还存在一条过氧化氢分流途径，其在驱动P450催化方面通常是低效的。在过去的几十年里，科学界不断努力使用定向进化或定点突变的方式将P450单加氧酶改造为过加氧酶和过氧化物酶，从而使P450能在不需要NAD(P)H和还原伴侣的情况下更好地利用过氧化氢来实现其催化功能。尽管这方面的研究已取得一些重要进展，但如何获得高效的非天然P450过氧化酶催化元件仍然是一个巨大的挑战。
研究团队近年来先后提出了“双功能分子协同P450酶催化”、“氧化还原敏感残基工程”和“H2O2隧道工程”三种创新性酶工程策略，成功实现由P450单加氧酶到非天然P450过氧化酶的功能转换，为极具挑战性的C-H键选择性氧化提供了独特的解决方案。该团队通过模拟天然过加氧酶UPO和天然过氧化物酶HRP的催化机制，开发了一种双功能小分子（DFSMs），DFSMs一端通过酰基氨基酸作为锚定基团与长链脂肪酸羟化酶P450BM3蛋白结合，另一端通过咪唑基协同P450血红素活性中心在H2O2的活化中发挥通常的酸碱催化作用，极大促进了P450酶利用H2O2的能力。从而成功将P450单加氧酶转化为过加氧酶（Angewandte Chemie International Edition, 2018. VIP & Frontispieces, Highlighted by ChemistryViews）。结合晶体学和理论计算证实，DFSM的加入有效地实现了加合物Fe-O-OH的O-O键异裂，因此有利于活性物种compound I的形成（ACS Catalysis, 2021a）。然而研究人员发现，该非天然P450酶催化体系往往需要高负载量的DFSM（甚至需酶用量的1000倍），严重限制其作为实际生物催化剂的应用。为此研究人员开发了以二肽（由天然氨基酸或非天然氨基酸组合而成）替代单个氨基酸作为锚定基团的二代DFSMs，在显著提高DFSM结合亲和力（2-3个数量级）的同时，使其在1：1负载条件下仍具有较高催化活性，从而大大提高了双功能分子协同P450过加氧酶系统的实际应用潜力（Angewandte Chemie International Edition, 2023a. Hot paper & Front Cover）。
研究人员同时结合酶工程对双功能小分子协同P450过加氧酶体系在催化高难度碳-氢键选择氧化反应进行了探索。结合底物口袋周围关键氨基酸残基的半理性设计，DFSM协同的P450BM3-H2O2过加氧酶系统实现了对小分子烷烃的羟基化，尤其是对小正构烷烃(C3 -C6)的选择性羟基化表现出优异的TON，优于已知唯一依赖H2O2的天然烷烃羟化酶AaeUPO，而生成2-丙醇的产物速率比所有报道的天然或工程酶系统都要好得多（ACS Catalysis, 2019）。在DFSMs存在下，工程P450BM3突变体对芳香醚的H2O2依赖性O-去甲基化表现出高催化活性和选择性，为木质素衍生单体的O-脱甲基提供了一条新途径（Catalysis Science & Technology, 2020. Front Cover）。DFSM协同的P450BM3-H2O2过加氧酶系统使未官能化的苯乙烯及其衍生物能够进行（R）-对映选择性环氧化，半制备规模合成得到43.8%的分离产率，展示了该体系在苯乙烯环氧化反应中的潜在应用。（Chemical Science, 2021. Back Cover, Highlighted by Natural Product Reports）。该系统在催化烷基苯的区域和对映异构羟基化方面也表现出优越性，结合半理性设计获得的有益突变体与不同的DFSM最佳组合，选择性地从具有sp3和sp2 C−H键多个反应位点的给定底物中获得不同的羟基化产物（Angewandte Chemie International Edition, 2023b. Hot Paper）。
通常认为P450过氧化物酶活性在合成上用途不大，因而相关研究一直受到忽视。基于P450过氧化物酶在碳-氢键氧化官能化方面可能发挥重要作用的科学假设，研究团队开发了氧化还原敏感残基工程策略，通过对P450蛋白表面及内部氧化还原敏感的氨基酸进行突变筛选和组合，成功获得了过氧化物酶活性极大改善的P450-H2O2催化体系，大大拓展了P450酶的催化多功能性（ACS Catalysis, 2021b）。在此基础上结合活性位点关键氨基酸的突变改造，成功实现了不饱和烃（包括苯酚、芳香胺和苯乙烯衍生物）的直接硝化反应，这不仅是P450首次催化苯酚和芳香胺的直接硝化，也是烯烃直接生物硝化的第一个例子（Angewandte Chemie International Edition, 2023c）。
研究人员发现非天然P450过氧化酶在实际催化应用中需要大大过量的H2O2，通过对天然过氧化物酶和天然P450过加氧酶的晶体结构进行分析后，提出可能是由于非天然P450酶中缺乏H2O2能够直接到达活性中心特定通道的假设，进而对P450酶现有水通道进行理性设计，开发出H2O2隧道工程策略，不但能够有效改善双功能分子协同P450过加氧酶的H2O2耦合利用效率，而且可以仅通过H2O2隧道工程即可将两种NADH依赖的P450单加氧酶改造为过加氧酶，表明H2O2隧道工程可能是非天然P450过氧化酶元件创制的一种普适性策略（Journal of the American Chemical Society, 2023）。
该评述以“Emerging strategies for modifying cytochrome P450 monooxygenases into peroxizymes”为题，近日发表于美国化学会《化学研究评述》（Accounts of Chemical Research）。以上工作得到国家自然科学基金和重点研发计划等项目的支持。（文/范圣贤 图/范圣贤）
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