甾体类化合物在药物研发领域具有重要地位，其生物活性的调控与提升主要依赖于羟基化反应。然而，由于甾体类化合物结构复杂，其分子内C-H键的区域和对映选择性羟化一直是化学合成领域面临的一个难题。近年来，P450酶因其在甾体类化合物羟基化方面展现出的潜力备受科研人员关注，但其活性高度依赖于价格高昂的辅因子NAD(P)H以及氧化还原伴侣为羟基化过程提供电子，这严重限制了P450酶在工业领域的广泛应用。

为解决这一难题，青岛能源所一碳生物技术研究中心丛志奇研究员团队将H₂O₂隧道工程策略与催化残基定点突变策略结合，基于H₂O/H₂O₂分子隧道的蛋白质工程改造，经过三轮筛选确定了天冬氨酸突变作为有效催化残基，获得的最优四突变体F92A/R114A/E282A/T248D（AAA/T248D）呈现出高效的过加氧酶活性，从而成功将NADH依赖性CYP154C5单加氧酶改造为P450过加氧酶。AAA/T248D将睾酮转化为单一的16α-羟基化产物，显示出迄今为止所有已知的天然和工程P450过加氧酶中对睾酮羟基化的最佳催化效率（kcat/Km=1.7×10⁷ M⁻¹min⁻¹）。同时，AAA/T248D还能高效地实现诺龙、雄烯二酮、孕酮的羟基化修饰，展现出广泛的底物适用性。

晶体结构分析表明，H₂O₂隧道工程在促进H₂O₂流入活性中心方面起着至关重要的作用，引入的天冬氨酸残基可充当水隧道的“门控开关”，帮助H₂O₂进入活性中心。研究人员进一步采用经典动力学模拟及增强采样技术对野生型和最优突变体的水分子流分析表明，AAA/T248D突变体显著增加了酶活性位点10Å范围内的水分子数量，D248侧链上的氧原子与底物C17上的羟基相互作用，使底物更靠近血红素中心，进而更容易被氧化。

此外， AAA/T248D成功实现了16α-羟基睾酮的毫克级制备，底物转化率超过98%，分离产率达90%，证明了其在合成应用方面的潜力。这项工作不仅为非天然P450过加氧酶的开发建立了一种更完善、可行的半理性方法，还为羟基甾体类化合物的酶促合成提供了高效的实用技术。这一成果为药物研发和工业生物制造领域注入了新的动力，具有重要的科学价值和应用前景。

相关工作发表在国际催化领域权威杂志ACS Catalysis上。青岛能源所范圣贤、秦鸣铭为论文的共同第一作者，丛志奇为通讯作者。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省泰山学者和青岛能源所强基计划等项目的支持。（文/图 范圣贤）

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c06342