一碳气体 (如CO₂、CO) 作为重要的游离性碳资源，储量丰富，主要来源于石化和冶炼企业排放的尾气，以及生物质、城市固废等加工处理后产生的合成气。利用固碳微生物将一碳气体转化为各类大宗化学品、生物燃料和微生物蛋白等，不仅可有效降低现有生物制造产业的原料成本，且有助于缓解一碳废气排放引发的环境问题，对工业和社会的可持续发展具有重要意义。

食气梭菌是厌氧梭状芽胞杆菌属的一类重要化能固碳微生物。它们通过伍德—永达尔途径能够有效固定CO/CO₂气体，并通过多条分支代谢途径合成乙酸、乙醇等产物，是构建一碳气体细胞工厂的理想宿主之一。目前，研究较多的食气梭菌包括永达尔梭菌（Clostridium ljungdahlii）、自产醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）和食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）等。近年来，国内外研究人员在提升食气梭菌发酵性能方面进行了广泛探索，分子遗传操作工具的发展，也使得食气梭菌的代谢工程改造以及合成生物学研究成为研究的重点。

近年来，成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白（Cas）基因编辑系统已成为一种广泛用于精准和无疤基因编辑的工具。现用于永达尔梭菌的CRISPR/Cas工具，将包括cas9基因、gRNA表达盒和重组模板DNA在内所有功能模块整合于一个质粒上，并由一种组成型强启动子控制cas9的表达。然而，Cas9持续高表达的毒性以及超大质粒造成质粒构建困难和转化效率极低问题亟待解决。

针对上述CRISPR/Cas工具的不足，青岛能源所一碳生物技术研究中心从永达尔梭菌细菌微室编码基因簇中挖掘并鉴定了两个诱导型启动子。利用具有高诱导活性的1,2-丙二醇诱导型启动子P_1,2-PD替换CRISPR/Cas一体化质粒中的组成型启动子来控制cas9的表达，有效解决了质粒构建困难和转化率低问题，实现了多个基因的100%精准敲除。另一方面，为应对一体化质粒太大的问题，研究团队将cas9基因整合到基因组上胆碱诱导型启动子P_choline1的下游，通过是否添加胆碱能够精确调控cas9的表达。随后，只需导入只含有gRNA表达盒和重组模板DNA的质粒，即可在重组菌株中实现高效的基因替换、敲除和敲入等操作。

图1 一体化质粒CRISPR/Cas系统和整合Cas系统示意图

该工作突出了诱导型CRISPR/Cas9基因编辑系统的有效性和便利性，丰富了食气梭菌的遗传操作工具包，在推进其遗传学研究和代谢工程改造方面具有重要意义。相关成果发表于微生物领域期刊Applied and Environmental Microbiology上。本研究还得到了中国科学院植物生理生态研究所分子植物科学卓越中心顾阳研究员的大力支持，同时也获得了中国科学院关键核心技术攻坚先导专项、国家自然科学基金、山东省自然科学基金的支持。（文/图 马小清）。

原文链接：https://doi.org/10.1128/aem.02183-24

Jun-Zhe Zhang, Yu-Zhen Li, Zhi-Ning Xi, Yue Zhang, Zi-Yong Liu, Xiao-Qing Ma*, Fu-Li Li*; Inducible promoters of bacterial microcompartments improve the CRISPR/Cas9 tools for efficient metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii, Applied and Environmental Microbiology, 2025, Mar 26:e0218324.