在原位极端环境下仍保持强劲代谢活力的“高耐受菌”对于诸多生物制造体系均具有重要意义。因此，这些原位高耐受性菌，一直是功能菌库建设的重要内容。但是传统挖掘策略通常是在选择压力下“先分离培养、后功能筛选”，依赖群落中单细胞或纯培养后细胞群体的“生长速度”来筛选菌株和验证其性能，存在耗时长、通量低、难以探测细胞原位代谢功能等关键局限。

白酒固态发酵是一个乙醇浓度不断升高的过程，因此在高乙醇阶段窖泥中维持高代谢活力的“高乙醇耐受”菌株是白酒发酵过程的关键，但获取这些菌株资源的流程极为繁琐。针对这一痛点需求，青岛能源所单细胞中心与中粮营养健康研究院微生物创新研发中心的合作团队提出，将筛选思路从在胁迫下“能否生长”变为“是否保持高代谢活力”，直接以群落中单细胞在乙醇胁迫下的代谢活力作为“原位耐受乙醇能力”的分选依据。

为实现这一原位耐受功能“先功能筛选、后分离培养”的思路，团队耦合重水（D₂O）饲喂单细胞拉曼光谱技术与前期研制的高通量拉曼流式细胞分选仪（FlowRACS），构建了高通量的“乙醇胁迫群落—单细胞重水拉曼读取—单细胞拉曼流式分选—获得纯培养物—单细胞拉曼耐受性验证”的完整闭环。窖泥中代谢活跃细胞会将D₂O中的氘掺入新合成的生物分子，产生特征性、定量的拉曼C-D峰；据此计算碳氘比（CDR）和拉曼耐受指数（RTI），定量刻画单细胞在乙醇胁迫下代谢能力的保留程度，也就是原位的乙醇耐受性。方法学验证实验表明，基于FlowRACS系统的拉曼流式分选流程，能以2,400 cells/h的通量、91.3%的准确率分选出原位高乙醇耐受性的细菌细胞。

从经预处理的窖泥样本出发，在8%乙醇预胁迫下，仅一次拉曼流式分选（门控阈值设为高活性群体对应的CDR > 0.08），获得了6株纯培养菌，并全部通过基于单细胞拉曼的表型验证（RTI均高于50%），展示了对8%乙醇的高耐受能力。而在乙醇胁迫下基于传统琼脂糖平台涂布分离策略挑取的9株中，仅有2株达到高耐受标准，而且纯培养物的峰值乙醇耐受能力显著低于拉曼流式分选策略获得的优良菌株。据此，这一拉曼流式分选耦合培养技术能获取更高耐受性能的功能菌，而且将菌株挖掘（分选）效率提升4.5倍，纯培养后的表型验证效率则提升约7倍（拉曼流式评估可在小时级完成），使分选与验证这两个核心环节的耗时由传统的“天级别”压缩至“小时级别”。

其中，植物乳杆菌（RTI = 85.1%）和表皮葡萄球菌（RTI = 62.2%）的基因组与转录组分析发现：乙醇胁迫后，前者显著上调了乳酸脱氢酶（ldh，表达量升高约3.4倍），并维持着乙醇脱氢酶（adhE、adhP）的高表达，体现的是发酵与氧化还原平衡的适应性调节。然而，后者激活了脂质合成与甘油代谢相关基因（如fabI、acpP、gldA），意味着细胞膜及细胞包膜结构的重塑。同时，两株菌均上调了乙醇脱氢酶、胁迫响应及核糖体等相关基因，并下调了糖代谢与磷酸转移酶系统（PTS）基因。这些物种特异性的乙醇胁迫响应机制同时也表明拉曼流式分选耦合培养技术能获取机制多样的原位耐受菌。另外，这些菌虽在原始窖泥群落中不占数量优势，却在高乙醇阶段展现出关键耐受活力，说明该技术通过“功能表型”与“数量优势”的解耦，能捕捉到传统策略容易错过的稀有功能类群。

因此，流式拉曼分选耦合培养技术不仅能获得更高性能的原位功能菌，同时还在从菌株筛选到性能验证全流程的速度、耗材成本等关键效率指标上有数量级提升。面向产业应用，该技术可拓展至耐酸、耐盐、有机溶剂耐受等诸多场景，助力高鲁棒性工业底盘菌株库与耐酸基因元件库的构建，并加速微生物资源获取与性能评价的自动化、智能化与标准化。

作为单细胞原位代谢图谱（iMAPS; www.iMAPS.info）国际科学计划在生物制造/合成生物学板块的进展之一，本研究为传统发酵工业的功能菌种挖掘提供了新案例。

该成果发表于Bioresource Technology《生物资源技术》。青岛能源所联合培养博士生徐腾、青岛能源所博士生孙晴、荆功超工程师为共同第一作者，青岛能源所张佳副研究员、王喜先研究员、中粮营养健康研究院郑晓卫博士为共同通讯作者。本研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省重点研发计划等资助。（文/张佳 图/刘阳）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.135397

Teng Xu^#, Qing Sun^#, Gongchao Jing^#, Yongming Duan, Xiaohang Wang, Xinyun Yi, Changle Wu, Huizi Zhu, Bo Ma, Jian Xu, Xiaowei Zheng*, Xixian Wang*, Jia Zhang*. Metabolism-driven and high-efficiency mining of ethanol-tolerant microorganisms from pit mud microbiota using Raman-activated cell sorting. Bioresource Technology, 2026.